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2017/01/10

Microscopía óptica

  Unknown       2017/01/10

Esta técnica se basa en la observación de las células y los tejidos por medio del microscopio óptico. Este instrumento, ideado en el siglo XVII, abrió el camino de la investigación celular gracias a los estudios realizados por Robert Hooke y otros contemporáneos suyos. Hoy en día, aun continua siendo muy útil, tanto en la investigación como en otros campos (microbiología, medicina...).

El microscopio óptico se basa en la capacidad de la luz para atravesar superficies muy finas. Contiene varias lentes que proporcionan un aumento de hasta 1500 veces y un poder de resolución de 0,2 m. Es preciso llevar a cabo una serie de operaciones sobre el material que se quiere observar, para obtener una preparación; es decir, una muestra tratada para conseguir el máximo rendimiento del microscopio. Elaboración de preparaciones En la mayor parte de los casos, procedemos del modo siguiente:

Fijación: Esta operación estabiliza los componentes celulares, con el objetivo
de que su aspecto sea tan parecido como sea posible al del tejido vivo. Empleamos formaldehido, ácido acético y alcohol etílico.

Deshidratación: El agua es un componente muy abundante en la mayoría de los
Tejidos y conviene eliminarla de la muestra para facilitar las operaciones posteriores. Para ello, sumergimos la muestra en diversos baños de alcohol de graduación creciente hasta llegar al alcohol absoluto, que produce una deshidratación total.


Inclusión: Los tejidos son, mayoritariamente, blandos y frágiles, por lo que resulta muy difícil hacer cortes finos sin estropear el material. Para evitar este problema, añadimos a la muestra una sustancia liquida que se interpone entre los componentes del tejido y que, después, se solidifica. Esta sustancia es, habitualmente, la parafina.



Corte: Cortamos la muestra incluida en parafina y solidificada en láminas muy finas con el micrótomo. Obtenemos cortes de 1 a 25 μm de espesor que permiten el paso de la luz.

Existen distintos diseños de micrótomo. En los modelos más sencillos, el corte se hace a mano con una cuchilla muy afilada. En otros casos, los micrótomos incorporan automatismos y son más precisos.

Montaje: Colocamos los cortes sobre un portaobjetos y cubrimos con xileno (o xilol), para eliminar el material de la inclusión y dejar la muestra lista para la acción de los colorantes.

Tinción: Las células, en su estado natural, son transparentes e incoloras y resultan, por lo tanto, casi invisibles; por ello, requerimos la aplicación de colorantes. Los colorantes presentan especificidad para unas sustancias concretas. De este modo, tuvimos compartimentos celulares en los que predomina en su mayoría una determinada sustancia. La utilización de diversos tipos de colorantes sobre una célula permite distinguir distintos componentes celulares.

Una de las técnicas de tinción más usada es la aplicación de hematoxilina y eosina (H-E). La eosina tiene carácter ácido y, por afinidad química, tiñe de color rosado las zonas de la célula en las que predomina el pH básico, fundamentalmente el citoplasma.

La hematoxilina es de carácter básico y tiñe de color azulado los componentes ácidos de la célula. Por ello, es útil para destacar zonas, como el núcleo y algunas regiones citoplasmáticas, debido a su contenido en ácidos nucleicos. Después de aplicar los colorantes, lavamos el exceso y colocamos un cubreobjetos sobre la muestra.

Conservación: En el caso de las preparaciones que queremos conservar, sellamos el cubreobjetos con sustancias, como el bálsamo del Canadá, que evitan la entrada de aire y la putrefacción de la muestra. Otra técnica habitual en microscopia óptica es el frotis, que llevamos a cabo con sustancias liquidas o semilíquidas, como la sangre, que extendemos sobre un portaobjetos formando una capa fina. A continuación, realizamos los procesos de fijación, deshidratación y tención, y podemos observar la preparación sin necesidad de cubreobjetos.



El micrótomo de rotación puede
Hacer cortes de 1 a 25 μm de espesor.

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